原子力顯微鏡主要有三種不同的工作模式，分別是接觸模式、非接觸模式以及敲擊模式，其中：
　　1、接觸模式：從概念上來理解，接觸模式是顯微鏡直接的成像模式。在整個掃描成像過程之中，探針針尖始終與樣品表面保持緊密的接觸，而相互作用力是排斥力。掃描時，懸臂施加在針尖上的力有可能破壞試樣的表面結構，因此力的大小范圍在10-10～10-6N。若樣品表面柔嫩而不能承受這樣的力，便不宜選用接觸模式對樣品表面進行成像。
　　2、非接觸模式：非接觸模式探測試樣表面時懸臂在距離試樣表面上方5～10nm的距離處振蕩。這時，樣品與針尖之間的相互作用由范德華力控制，通常為10-12N，樣品不會被破壞，而且針尖也不會被污染，特別適合于研究柔嫩物體的表面。這種操作模式的不利之處在于要在室溫大氣環境下實現這種模式十分困難。因為樣品表面不可避免地會積聚薄薄的一層水，它會在樣品與針尖之間搭起一小小的毛細橋，將針尖與表面吸在一起，從而增加尖端對表面的壓力。
　　3、敲擊模式：懸臂在試樣表面上方以其共振頻率振蕩，針尖僅僅是周期性地短暫地接觸/敲擊樣品表面。這就意味著針尖接觸樣品時所產生的側向力被明顯地減小了。因此當檢測柔嫩的樣品時，AFM的敲擊模式是最好的選擇之一。一旦AFM開始對樣品進行成像掃描，裝置隨即將有關數據輸入系統，如表面粗糙度、平均高度、峰谷峰頂之間的最大距離等，用于物體表面分析。同時，AFM還可以完成力的測量工作，測量懸臂的彎曲程度來確定針尖與樣品之間的作用力大小。
　　三種工作模式的對比與比較：
　　1、接觸模式：1）優點：掃描速度快，是唯一能夠獲得“原子分辨率”圖像的AFM垂直方向上有明顯變化的質硬樣品，有時更適于用Contact Mode掃描成像。
　　2）缺點：橫向力影響圖像質量。在空氣中，因為樣品表面吸附液層的毛細作用，使針尖與樣品之間的粘著力很大。橫向力與粘著力的合力導致圖像空間分辨率降低，而且針尖刮擦樣品會損壞軟質樣品（如生物樣品，聚合體等）。
　　2、非接觸模式：1）優點：沒有力作用于樣品表面。
　　2）缺點：由于針尖與樣品分離，橫向分辨率低；為了避免接觸吸附層而導致針尖膠粘，其掃描速度低于Tapping Mode和Contact Mode AFM。通常僅用于非常怕水的樣品，吸附液層必須薄，如果太厚，針尖會陷入液層，引起反饋不穩，刮擦樣品。由于上述缺點，on-contact Mode的使用受到限制。
　　3、敲擊模式：1）優點：消除了橫向力的影響。降低了由吸附液層引起的力，圖像分辨率高，適于觀測軟、易碎、或膠粘性樣品，不會損傷其表面。
　　2）缺點：比Contact Mode AFM 的掃描速度慢。